Набор реагентов для окраски микроорганизмов по Граму (с фуксином Циля)
Назначение
Набор реагентов для окраски по Граму предназначен для окраски микроорганизмов и выявления принадлежности бактерий к грамположительным или к грамотрицательным группам.
Принцип реакции
Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристалвиолет.
Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.
Грамотрицательные Грам (-) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Реагенты
Набор обеспечивает 200 исследований (при расходе 0,5 мл реагента на одно исследование).
- Карболовый раствор генцианвиолета 1 фл (100 мл)
- Раствор Люголя 1 фл (100 мл)
- Фуксин Циля 1 фл (10мл)
Подготовка к анализу
Предметное стекло перед исследованием должно быть тщательно вымыто и обезжирено смесью для обезжиривания предметных стекол пр-ва «АБРИС+».
Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова , жидкость Карнуа. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе .
Либо полученные мазки тщательно высушивают и затем фиксируют сухим жаром. Фиксация достигается посредством несильного нагревания (примерно до 70°С) предметного стекла, которое для этого трижды проводят над пламенем спиртовки мазком вверх.
Приготовление рабочего раствора фуксина Циля
Перед использованием фуксин Циля разводят в 10 раз дистиллированной водой. (Из расчета - к 1 мл фуксина добавляют 9 мл дистиллированной воды).
Методика окраски
- Помещают на мазок полоску фильтровальной бумаги и наносят на фиксированный мазок несколько капель карболового раствора генцианвиолета (реагент 1) и выдерживают 2-3 минуты. Сливают краску, удаляют фильтровальную бумагу и споласкивают в проточной воде (до 30 сек).
- Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя (реагент 2) до почернения препарата.
- Раствор сливают, мазок промывают водой (водопроводной или дистилированной).
- Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают. Если вместо спирта использовать ацетон, то промывание продолжается 30 сек. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.
- Тщательно промывают стекло в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин
- Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают рабочим фуксином Циля (несколько капель) в течение 1-3 минут.
- Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.
Окрашенные мазки исследуют в масле, с иммерсионным объективом; при желании заключают в бальзам, в таком случае на окрашенный и хорошо высушенный мазок кладут каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.
Результат окраски
Грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет (темно-синий), а грамотрицательные - розово-красный, красный или коричневый.